Y luego, bueno, pues ya recabo en el NIDA,
en el National Institute for Drunk Abuse,
en los Estados Unidos,
para investigar sobre cuestiones que nos va a contar
y que serán muy interesantes,
pero sobre todo orbitan alrededor de las asambleas neuronales
o ensambles, ¿no?
Y en el contexto de las adiciones.
Pero como digo, no quiero hacer mucho spoiler,
salvo que decir que Javier lleva mucho tiempo
investigando en estas cuestiones,
por supuesto que tiene muchas publicaciones muy relevantes
y que yo desde luego tenía muchas ganas de conocerle
porque llevo leyendo trabajos en los que ha estado implicado
durante muchos años, trabajos suyos también.
Y bueno, es una alegría tenerte aquí, Javier.
Y en el poco tiempo que le llevo conociendo en persona,
que hemos estado en ese congreso juntos,
la verdad es que también puedo decir que es una maravillosa persona.
Y esto además me consta que lo comparte esta opinión
mucha gente.
Así que nada, nada más, Javier.
Muchísimas gracias por venir, por tu generosidad
y estamos ya pendientes de lo que nos cuentas.
Gracias, Alejandro.
¿Se escucha bien?
¿Sí?
Vamos a ver si funciona aquí.
Bueno, primero quiero dar gracias.
Es un honor estar aquí porque me siento muy español,
pero en España no he tenido ocasión de hablar mucho,
así que este mes de septiembre ha sido muy bueno.
Vamos a ver.
Os voy a contar un poquito, a ver si aparece esto.
¿Se ve completo?
No.
¿Cómo se puede ver completo?
A ver.
A lo mejor, a lo mejor tengo, a ver.
Ahí está.
A lo mejor desde aquí.
A ver, aquí le doy.
Yo lo veo completo.
Ah, ¿se va a ver así?
Sí.
Ok, vale, entonces yo vale, muy bien creo
que me voy a sentir raro sentado pero es que está muy
bajo el ordenador entonces yo creo que voy a permanecer sentado
porque si no, no voy a poder ya, muy bien cuando aparece esto,
¿qué debo hacer?
a ver.
Muy bien, pues les quiero contar una breve introducción
de cómo llegué a ser científico.
Y bueno,
pues vengo ahora mismo de Consuegra, que es mi pueblo,
como dicen aquí, como decimos,
el pueblo donde nací.
Yo nací en Consuegra, un pueblo de Toledo
que tiene como 10.000 habitantes.
Y bueno,
pues es muy bonito el que no lo haya visto.
Pues aquí tengo una pequeña foto.
Esa es parte de los molinos y el castillo medieval.
Y alrededor está el pueblo.
Entonces, de ahí vengo.
Han sido las fiestas ahora.
Y bueno,
o sea, de ahí provengo.
Y de aquí vengo.
De aquí vengo ahora.
De Baltimore, que está en el estado de Maryland.
En Estados Unidos, y esa foto es muy bonita,
aunque todos pintan muy negro Baltimore,
porque es una de las ciudades con mayor sobredosis
y problemas de drogas.
Bueno, pues tiene su parte bonita también, ¿no?
Entonces.
Titulé esto de tal palo, tal astilla.
Uno normalmente ve de dónde viene en la familia.
Y encontré esto, ahora que fui a mi pueblo,
encontré esta foto de mis abuelos.
Entonces, a ver si.
Pues este es mi abuelo Amalio,
que nació hace dos siglos, en 1898.
Entonces, seguramente Ramón y Cajal ya estaban dibujando neuronas,
pero mi abuelo lo que hacía era pastor,
cuidaba ovejas.
Entonces, ¿cómo puede venir de ahí un científico?
No lo sé.
Pero bueno, ese es mi abuelo, uno.
De mis abuelos, aquí mi abuela Teresa y aquí los otros dos abuelos,
Justa y Nicolás.
Y mi otro abuelo era agricultor, nada que ver con ciencias tampoco.
Entonces, de tal palo a tal astilla no funciona por aquí.
Mi padre tampoco fue, no estudió, no era constructor.
Entonces, yo soy la primera generación de estudiantes
en mi familia que fue a la universidad.
Bueno.
Pues aquí estoy, solo para mostrar que tenía pelo,
cuando terminé la Facultad de Química,
primero estudié tres años en la Universidad de Castilla-La Mancha,
Ciudad Real, y después salté,
pedí a que me aceptaran en el programa de Bioquímica
y Biología Molecular,
que era lo que más me gustaba en la Universidad Autónoma.
Entonces con una amiga nos fuimos para allá, nos aceptaron,
Y estuve el resto de los dos años.
Después de terminar, no sabía qué hacer,
porque como toda la vida había estado estudiando,
y he empezado la carrera de bioquímica, y bueno,
pues como eran dos años más, entonces me apunté.
Me apunté a bioquímica y cuando ya llevaba dos años
y había sacado alguna buena nota.
Tuve la oportunidad de empezar el doctorado,
así que le dije a mi supervisor que si, que ya hacía,
pues continué las dos cosas.
Entonces estuve con el doctorado, a veces hacía prácticas
y yo preparaba también las prácticas porque era del doctorado,
pero bueno, así terminé bioquímica y el doctorado en el 2001 ya.
Bueno, mi doctorado lo hice en el CVM Severo Ochoa y bueno,
pues fue en biología molecular y celular
y como dijo Alejandro, pues en terapia génica y celular
en la enfermedad de Parkinson.
Entonces trabajé mucho con células troncales del sistema nervioso,
de ratón, de rata y de humano.
Muy bien.
El segundo, terminé la tesis
y decidí hacer un break o dejar la carrera de científico.
No lo tenía muy claro.
Tenía 27 años, tenía dos carreras,
tenía el doctorado y no tenía muy claro
si quería seguir por ese área porque había visto
algunas cosas que no me gustaban de algunos científicos.
Entonces yo no quería seguir en ese área, ¿no?
Entonces, me fui a buscar mi vocación.
Primero me fui a unas misiones a Ecuador.
Ahí tengo una foto de recuerdo que también la saqué
este fin de semana del álbum de los recuerdos.
Y ahí estoy, bueno, pues con una abuelita
y su hija en Ecuador disfrutando.
La verdad, disfruté un mes.
Después de hacer el doctorado
y estar tres meses encerrado en una sala oscura,
irte a Ecuador y no tener que pensar,
solamente caminar y hablar con las personas sencillas,
fue de verdad muy bueno esa estadía.
Y después, como seis meses después, me fui a Chile.
Me fui a Chile, me fui a hacer un año de misiones
y a buscar mi vocación y resulta que la encontré.
Encontré a mi mujer allí y nos casamos, vinimos aquí a España
para casarnos y tenemos dos hijos que ya tienen 18 y 16 años.
¿Volver a empezar de cero?
Bueno, pues había dejado la ciencia como dos años, ¿no?
Había cortado así de golpe.
Entonces, empezar de cero fue imprimir mi currículum,
ir a la Universidad de Chile
y llamar a la puerta del laboratorio.
Así literalmente.
Había correo electrónico seguramente,
pero lo hice así.
Y encontré de nuevo el gusto a la ciencia
por el ambiente que encontré.
Primero fue en la Universidad del Desarrollo,
en la Facultad de Medicina,
una universidad privada.
Y ahí continué el trabajo de terapia celular,
pero ahora con células somáticas derivadas de la médula ósea.
Entonces, aspectos éticos que no me gustaban,
trabajar con células humanas, fetales, en mi tesis,
pues aquí me reinventé también con eso.
Y tampoco era tratamiento epigenético,
entonces tenía mucha aplicabilidad para humanos.
Y bueno, ahí estuve cuatro años,
muy bien.
Empecé de nuevo, ¿no?
Empecé de cero y el contexto fue muy agradable.
Siempre digo, el contexto es lo importante,
no las publicaciones, la consecuencia.
Pero si vas a publicar bien y vas a estar amargado en un sitio,
es mejor irse a otro.
Bueno, después de cuatro años me busqué otro sitio
y fue la Universidad de los Andes, también en Chile,
y ahí empecé un poquito más neurociencias,
más clásicas, ¿no?
Plasticidad, el efecto de los antidepresivos
en el sistema glutamatérgico, modelos de depresión y memoria.
Ahí empecé a hacer mis pinitos, como dicen,
con la conducta.
Ya no sabía hacer conducta,
empecé a hacer por mi cuenta ahí, Option Reconnection Memory,
de ese tipo de test sencillos.
Y después decidí viajar porque una cosa que no les he contado,
durante mi tesis fui a Viena a dar una pequeña charla
invitado por mi jefe.
No había practicado la charla, mi jefe no quiso practicarla conmigo
y tuve un trauma con el inglés tremendo.
Entonces fue un trauma que me duró bastantes años
y decidí pues eliminar ese trauma yendo a un congreso.
Entonces fui al congreso a Cold Spring Harbor
y ahí conocí a Bruce Hope,
con el que he continuado trabajando todo este tiempo.
En una comida, amistosa, riendo y bueno,
le invité a Chile y ahí empezó todo, ¿no?
Pues empezó todo, pedí una beca.
En noviembre del 2012
llegamos a Estados Unidos con los niños pequeños
como postdoc viejo, por decirlo así, con una beca de Chile
y como investigador extranjero allí.
Pues era por dos años, temporal.
Y después se alargó un año más y después al tercer año mi mujer
me dijo que si nos quedábamos porque todo el mundo estaba más feliz
en la familia,
así que decidimos quedarnos con algunos problemas de trámites,
no como ahora.
Que hay que pagar 100.000 dólares para la visa de trabajo.
No tuve que pagar tanto, pero bueno.
Y una nueva área de investigación.
Entonces, de nuevo cambié.
Ahora me fui al branch de conducta.
Pero con mi background, con mi.
Bueno, voy a.
Ya no sé si mezclo alguna palabra en inglés.
Pues bueno.
Entonces me dediqué a aprender FACS, o citometría de flujo,
y cómo utilizarla para aislar neuronas.
Ya lo habían hecho en el laboratorio de Bruce Hope,
pero lo habían hecho usando hasta siete.
Siete ratas tenían que combinar para tener suficiente.
Entonces lo optimizamos para que fuera solo
de un animal pudiéramos obtener buenos resultados
y estudiar alteraciones solamente en las neuronas que se activaban
o en samples.
Entonces, después ya pasé a Staff Scientist,
después de un periodo de exilio en Chile de cinco meses y tramiteos,
y luego ya me hicieron Staff Scientist,
que es empleado federal, o sea, trabajo para el gobierno,
desde el 2019.
Y ahí le voy a contar un poco después de todo lo que he hecho
estos 12 años o 13 años.
Y actualmente pues soy una especie híbrida.
En marzo del año pasado me hice americano
y ahí para la foto me puse unos zapatos de España
de la boda de mi hermano, me puse mi chaqueta
de matrimonio en Chile y me compré una corbata de Estados Unidos
para demostrar la variedad.
Y bueno,
pues ahí estoy de momento.
Y bueno,
pues sin más, voy a empezar con la presentación ahora.
Y bueno,
pues el título de la presentación es Encontrando
la, no sé cómo se dice, signature, memory signature,
en la sinapsis asociada a memorias con drogas, cocaína, mezanfetamina
y con comida.
Muy bien, pues Ramón y Cajal, que es uno de mis favoritos
y que nació en el siglo que nació mi abuelo,
aunque fue increíble, pues se apoyó desde el momento en el que
se descubre la neurona, que es un ente individual
y que forma parte de la estructura individual del cerebro.
Se adquiere lo que se llama la doctrina de la neurona,
con las características que tiene una neurona.
Tiene un soma, tiene un árbol dendrítico
y tiene el axón.
Cuando se estudia la memoria,
primero se suele empezar por qué región del cerebro
es la importante para esa memoria.
Se hacen inactivaciones
o se hacen estudios de imágenes para ver qué región se activa
y luego se comprueba si esa región está implicada en cierta conducta.
Obviamente, con todo el desarrollo de los abordajes virales,
se puede entender y estudiar los distintos circuitos
que hay en el cerebro para entender la memoria y la conducta.
Y, por supuesto, los diferentes tipos de neuronas.
En el caso del estriado tenemos los D1 y D2
y cuál está implicado en una u otra conducta.
Sin embargo, tanto una región cerebral
como un circuito, como un tipo de neurona,
Solo estudiando eso o en combinación,
a veces no nos da o no nos da la explicación necesaria
para entender la alta especificidad de algunas memorias.
Entonces, ahí es donde surge.
Pues este libro de Donald Hebb que habla por primera vez
de la hipótesis del cell assembly o una asamblea,
un grupo de células que están activándose de manera sincrónica
y codifican una memoria específica.
Y eso es en lo que estudiamos ahí en el laboratorio de Bruce Hope,
en la hipótesis general.
Entonces, en un cerebro puedes tener distintos tipos de neuronas.
No todas se activan cuando se aplica
o cuando en presencia de una clave o una cue.
Y algunas de ellas se van a activar con.
Una Q independiente de droga
y otras se van a actuar con una diferente.
Entonces pueden convivir distintos ensambles
dentro de una región y esos ensambles pueden ser de uno, de dos,
la proporción la podemos estudiar después,
pero lo que miramos es el estado de actividad.
No el fenotipo en sí, sino el estado de actividad,
si está activo o no está activo.
Y se comprueba si tiene que ver, tiene un efecto causal,
que es lo que les quiero presentar aquí.
La primera vez que se demostró,
también en el laboratorio de Bruce Hope,
se utilizó este método de inactivación solo
de las neuronas que se activan
o que expresan FOSS.
Entonces se usó ratas transgénicas que expresan beta-galactosidasa
y en presencia de Dono2, que es una droga no tóxica,
pero a través de la beta-galactosidasa se transforma
en un producto tóxico que se llama Donorobicin.
Y entonces mata específicamente solo las neuronas que estaban expresando
beta-galactosidasa y esas solo lo expresan las que tiene el promotor
FOS, o sea, las que se han activado en respuesta a un contexto
o una clave.
Entonces, la primera vez que se demuestra
que tiene un efecto causal, y esto,
bueno, pues uno de los primeros, uno de los experimentos donde se ve
aquí en la barra negra que después de Donautu,
el seeking, El número de veces que presiona para obtener la droga
disminuye considerablemente, demostrando que hay un efecto causal
cuando se eliminan solo esas neuronas.
Bueno, pues hay varios papers ya demostrando
esa y estamos abiertísimos a que quien quiera usar
esas ratas que nos las pida y que las usen.
Muy bien.
Pues aquí es cuando llegué yo con esta cosa
de poder estudiar cambios moleculares dentro de los ensambles.
Y el abordaje clásico era estudiar toda la región del cerebro.
Pues se obtiene, se hace una disección y se hace PCR,
RNA-seq o lo que uno quiera hacer, Western Blot.
Entonces, lo que queríamos o lo que hacemos es separar,
por un lado, las neuronas que no están activas
y las otras que están activas, basado en la expresión de Foss.
Entonces, este es el primer paper que publiqué en colaboración
con Tim.
Liu, donde vimos que si tomamos clásicamente
un trozo de cerebro del estriado, dorsal estriatum,
Podemos ver el aumento de FOS después de inyección
con metanfetamina, otros inmediately genes como FOSB, pero por ejemplo ARK
y HOMER2 no vimos significativamente ningún aumento
cuando vemos el conjunto.
Sin embargo, cuando podemos disociar y purificar solo los ensambles,
que es como un 3% nada más, del resto,
que por cierto está diluido, cuando haces
homogenizado está diluido y por eso no llegábamos a ver tanto efecto.
Era una manera de demostrar que nuestro procedimiento servía,
fue hacer el fax,
aislar FOS negative, FOS positive y ver ahora que hay un cambio
de hasta 10 veces más en el orden de magnitud
y ahora cambios en genes que no se veían antes,
ahora se empiezan a ver.
Entonces, con esta técnica podemos ver cambios específicos
en los ensambles que de otra manera no lo podríamos ver.
Y bueno, pues eso lo aplicamos a conductas más complejas
como Context Induced Race Statement y aplicamos y encontramos
distintos resultados.
Os voy a mostrar un resumen, por ejemplo,
de lo que se puede encontrar.
Cuando se hace el reinstatement,
pues las ratas se ponen en un contexto donde toman la droga,
después se ponen en otro contexto donde se hace la extinción
y después vuelven al contexto original
o en el contexto de extinción.
Entonces, lo que vimos es que había genes que se expresaban solamente
en el contexto de extinción, o sea, memorias de extinción,
porque hay una memoria que aprende que no hay droga,
o sea, es otra memoria.
Y, por ejemplo, OMERTU y SIVIAR, el receptor de canabinoides.
Uno.
Entonces, esos dos son específicos de la memoria de extinción,
mientras que vimos el Green2A del receptor de NMDA2A,
que está aumentado solamente en el contexto de metanfetamina,
cuando hay reinstatement.
Por supuesto, teníamos que comprobar esto
y lo comprobamos haciendo in situ hybridization,
con lo que ya se conoce como RN-SCOPE,
Y esto es solo para demostrar que en cada FosPositive
podemos encontrar un aumento en el número de puntitos.
Cada puntito es una molécula de RNA,
se supone.
Entonces puedes cuantificar cuánto RNA para Green2A
hay dentro del ensamble.
Sin embargo.
El Green2A no está en el soma.
La función del Green2A y la proteína está en los terminales.
Su función es en la sinapsis.
Entonces,
necesitamos técnicas para poder ver estos cambios funcionales
en la localización donde realmente se expresan.
Entonces, aquí es donde empieza el nuevo contexto que introduzco
en los últimos años, que es en vez de hablar de Neuronal Ensembles,
hablar también de Synaptic Ensembles.
O sea, vamos a ver las sinapsis que se activan,
porque ahí es donde están ocurriendo el primer input
y los primeros cambios que empiezan a formar parte de la memoria.
Entonces, necesitamos alta resolución,
obviamente, para estudiar la sinapsis.
Y esto es lo que ya habíamos visto,
con FACS lo podemos hacer a nivel de soma,
podemos estudiar RNA en el laboratorio
y el ACK-COIA también, que fue el primero que publicó,
el Donautu, lo vio en electrofisiología,
pueden hacer patch de las células.
Fos-positive o negative con transgénico
que expresa la proteína verde y ver la relación
y la respuesta entre NMDA y Amparoceptor.
Entonces, lo que me interesa y les voy a contar ahora
es cómo podemos responder a una de estas,
cómo estamos respondiendo a estas preguntas en proceso.
¿Cómo podemos estudiar lo que es el Synaptic Ensemble?
Si hay una Memory Signature, ¿cuál es ahí?
Si hay un marcador de activación, como FOS,
pero que esté en las espinas dendríticas,
y cómo hacer un estudio a profundidad de las proteínas
y los cambios que ocurren a ese nivel,
en las sinapsis que están aquí en rojo,
las sinapsis activas.
Desde 1888 que Ramón y Cajal dibujó estas neuronas
y con esas pequeñas protrusiones que se llamaban espinas dendríticas,
lo que os voy a mostrar es cómo nosotros estamos ahora
haciendo los estudios a nivel de plasticidad sináptica,
a nivel estructural, usando métodos virales
y análisis de imágenes.
Después os voy a hablar un poco de cómo estudiar alteraciones
solamente en las sinapsis activas
y para eso de nuevo volví a usar citometría de flujo,
ahora con sinaptoneurosomas.
Y para encontrar algunos candidatos marcadores de actividad.
Y por último,
pues algunos estudios que ya están en marcha y hacia dónde queremos ir.
Como por ejemplo el Deep Proteomics
y hacer lo que se llama Expansión Microscopy,
alargar el cerebro para poder tener más resolución.
Bueno, pues.
¿Cómo la memoria está alterando las espinas dendríticas
en los ensambles?
Esa era la pregunta principal de este proyecto.
Para eso usamos ratas, nos fijamos en el núcleo Cumbens Core.
Tenemos con una mezcla de virus,
podemos solo marcar algunas neuronas,
igual que el Golgi con Ramón y Cajal,
pero a nivel de virus con la proteína verde.
Ella es la estudiante, o se llama post-bac,
después de terminar el college, pues tiene un periodo de dos años,
está el tercer año conmigo y ha estado muy implicada
en este proyecto, EMEN.
Y bueno,
ahí veis cómo se ve, pues que hay algunas neuronas que están marcadas,
no todas, y por tanto la que está en verde
podemos ver en detalle las dendritas y las espinas.
Y aparte, haciendo una inmunohistoquímica,
podemos detectar cuál de ellas es FOS positive, está activada,
y cuál no.
Entonces podemos tener dos neuronas de distinta activación
en la misma región del cerebro y hacer el análisis
y ver qué diferencias hay.
Entonces aplicamoslo que es self-administration con cocaína,
hay entrenamiento, bueno, pues vosotros también sabéislo
que es esto, se inyecta el virus después del entrenamiento
para evitar que influya durante el aprendizaje,
se deja en 3-4 semanas y después tenemos un grupo
control que es activación inespecífica, que es
en un ambiente nuevo, novel context, Se activan, no hay memoria,
pero es nuestro control positivo de Ensembles
y luego tenemos el control negativo que es mantenerlas
en su caja, Home Cage.
Bueno, veis que el entrenamiento funciona para los tres grupos
principales.
Hay un Seeking.
Y añadimos unos grupos,
no voy a mostrar aquí los resultados,
pero otros grupos control donde ratas
que no tienen historia de cocaína, cómo responden a un ambiente nuevo,
porque responden diferente.
La historia de cocaína modifica el cómo están reaccionando
al mismo estímulo.
Aquí tienen un ejemplo de dos neuronas, una es negativa,
la otra es positiva y lo que hacemos es a través de un programa,
el Neurolúcida 360, trazamos dendritas que son proximales,
menos de 50 micras y dendritas distales,
más de 70 micras.
Y realizamos la clasificación de las espinas en base
a la morfología.
Y pues ya saben, desde Filopodia, que es lo más inmaduro,
hasta lo más maduro que es Mazron, ¿no?
Eh.
Tenemos estos resultados en cuanto a la densidad de espinas
en la parte distal.
Solo estoy mostrando los resultados de la parte distal.
No hay ningún cambio cuando tomamos en cuenta
todos los tipos de espinas a la izquierda o a la derecha
cuando solo tenemos en cuenta los mushroom.
El número de espinas parece ser lo mismo.
Sin embargo, es interesante ver que cuando medimos la cabeza,
el diámetro de la cabeza de los mushroom, que son las más maduras,
Teniendo en cuenta todas las espinas,
no hay diferencias,
pero si solo nos focalizamos en las mushroom,
vemos que las que están cambiando son las false negative.
En un caso en las que son naif, que no tienen historia de cocaína,
disminuye considerablemente el diámetro
y en el caso del psiquen, de las de cocaína,
aumenta el diámetro.
Esto no lo esperábamos,
pero es una nueva ventana que, en términos generales,
yo lo entiendo como el contexto es importante
y la comunicación entre FOS negative y FOS
positive no sabemos mucho ahora.
Pero definitivamente no es lo mismo una FOS negativa después de cocaína
o después de psiquin
que en una rata que no tiene historia de cocaína.
Y lo otro que empezamos,
gracias a un colaborador que hace el código y pensando estas ideas,
¿qué más podemos analizar que no sea lo clásico?
Empezamos a ver, bueno, se ha oído hablar
de que las espinas pueden formar clústeres.
Y eso podría ser una especie de signature.
Entonces, lo que decidimos es empezar a medir la distancia
entre las espinas, ¿ya?
, Teniendo en cuenta cualquier tipo O ahora os voy a mostrar.
Solo las que son más.
¿Cuál es la distancia entre las espinas?
Si cambia el perfil Y fue interesante.
Cuando miramos todas las espinas.
Sin discriminar ningún tipo.
Bueno, el perfil en rojo.
Está las neuronas O las espinas de una.
Fos positive.
En azul de una fos negative.
No hay ningún cambio.
Sin embargo.
Cuando nos fijamos solo en los mushroom,
ya vemos una diferencia entre el novel context
y el cocaine seeking.
O sea, es diferente el perfil y ahora la mayoría
de las espinas después del cocaine seeking.
Hay como un 66% de las espinas
que su distancia es más o menos entre 1.25 y 2.75,
promedio 2 micras.
Entonces, la mayoría están ordenadas a esa distancia.
Entonces, eso que estamos aumentando el número de n
para comprobar que esto es así, Primero, nos indica que es distinto,
cuando no hay memoria, las espinas se comportan,
como ven aquí en novel context, se activan las células,
pero no hay diferencia entre la distribución
de las espinas, solo con el cooking-seeking,
y después, pues que, lo que les acabo de decir,
las false positives son las que tienen la mayoría,
un promedio de intervalo entre ellas de un 2 micras aproximadamente bueno
pues el pequeño resumen de esta primera parte es
tenemos una neurona que está activada y expresa fosa en el núcleo.
Sabemos ahora que las espinas, después del cooking-seeking,
están a una distancia más o menos de 2 micras, la mayoría,
de que la cabeza de las four negative es la que es mayor en las mushroom.
Entonces, cuando miremos input del PFC.
Al núcleo Cumbens,
tiene que ocurrir algo para que esas espinas que están ahí,
esas sinapsis que están a una distancia de dos micras,
se activen.
Es nuestra hipótesis.
Esta debería ser quizás una señal, una marca de que se está formando
o que se ha codificado ya una memoria.
Como un trazo físico que podemos ver.
Entonces, bueno, pues aquí es lo que vamos a hacer
y lo que vamos a hacer lo siguiente es,
estamos marcando los inputs de la corteza prefrontal con Chanerodopsin
mCherry en rojo y ver los contactos con las espinas
y poder medir la distribución y la morfología de esa sinapsis.
Esto está muy bien hasta ahora,
pero he hablado de espinas de las neuronas.
O de los neuronal ensembles,
pero eso no serían synaptic ensembles, según mi definición.
Porque no todas las espinas de una neurona activa
están activadas.
No todos los inputs están formando parte de esa memoria
o memory recall.
Entonces, ¿cómo estudiamos entonces solo
las sinapsis que se activan?
Ahí es donde viene el segundo proyecto.
Permitidme que beba un poquitito de agua.
Entonces, en el segundo proyecto, lo que hicimos fue inyectamos
con un virus que tiene channel redoxin,
es solamente para poder incorporar el fluoróforo dentro de la membrana
del terminal presináctico.
Entonces se inserta en la membrana, se inserta en el terminal
y podemos ver en secciones donde vemos el estriado,
podemos ver que está la parte medial del dorsal
estriado y la parte de núcleo cumbre, incluido el core,
está marcado con proteína verde.
Son los terminales que se expresan después de unas ocho semanas.
Lo que hacemos es, pues, hacemos un punch,
no sé ni cómo se dice, pero es un agujerito,
quitamos esa parte que es el núcleo accumbens core,
hacemos un homogeneizado y podemos, a través de centrifugaciones seriadas
y el gradiente de Percol,
podemos obtener un anillo que es rico en sinactonirosomas.
Y los sinactonirosomas.
Pues son estructuras como estas que ven aquí,
validadas en nuestra preparación,
donde veis la primera parte llena de vesículas, las flechas en verde
son vesículas que contienen dentro del terminal presináctico del axón
y luego tenemos la parte posináctica
y ahí vemos con una flecha blanca dos vesículas.
Densidades postsinácticas de la espina.
Y las dos están selladas.
Entonces podemos estudiar qué proteínas hay o en PRI
o en POS.
Ahora viene la parte interesante.
Es cómo usamos citometría de flujo
cuando estas partículas son muchísimo más pequeñas,
hasta 20 veces más pequeñas que una célula normal
o un soma.
Entonces,
pues ahí gracias a la colaboración con un instituto,
el Instituto de Envejecimiento, que está en el mismo edificio,
pues hemos podido ver e identificar los sinactoniosomas
haciendo citometría de flujo.
Y bueno, esto es solo para comprobar que tenemos una población principal,
los cuadrados que están en rojo indican pequeñas bits o bolitas
de un tamaño específico, sintético, de tal manera que podemos localizar
o validar el tamaño de la población que estamos buscando.
Entonces nuestra población estaría,
sería la población que está en verde,
que tiene la circunferencia en verde
y ahí serían los sinactonirosomas basado en el tamaño
y después lo que hacemos es distinguir en función
de la fluorescencia en este caso para proteína verde YFP
y vemos dos poblaciones en rojo la positiva que son terminales
que vienen del PFC o la zona prefrontal
y la de azul que es la negativa el resto.
De los sinactoniosomas y de otras contaminaciones.
Entonces, Validamos con anticuerpos comerciales
que reconocen sinactoficina y PSD95 y casi el 100% de ellos,
de los que vienen concretamente de los terminales
de la parte prefrontal al núcleo accumbens,
expresan ambos, están colocalizados.
Entonces, validamos, no solo que podemos verlos,
sino que podemos detectarlos con anticuerpos.
Comerciales.
Entonces, la siguiente pregunta
es, bueno, candidatos que tenemos de marcadores.
¿Qué marcadores podemos ver?
¿Qué anticuerpos tenemos?
Entonces, lo que hicimos, un experimento sencillo
donde se inyecta cocaína para activar a distintos tiempos.
Activar a distintos tiempos y lo que hacemos, bueno,
todo lo que les he mostrado ya.
Y aquí los candidatos que teníamos eran ARC, Calmulin-Quinasa
y la parte forforilada.
Ninguno de ellos tenemos diferencias significativas.
Sin embargo,
cuando miramos la subunidad S6 del ribosoma,
vemos a todos los tiempos que está aumentada
después de la inyección de cocaína.
Y un aumento transitorio en la proteína calcinurina,
que es la única que es calciodependiente,
la forfatasa calciodependiente del cerebro.
Entonces, estos dos candidatos quisimos seguir estudiándolos.
Primero vamos a validar, porque esto es citometría de flujo
y no todo el mundo puede creer que esto pasa.
Incluso uno mismo necesita verlo, ¿no?
Entonces, para verlo, pues tenemos de nuevo.
Pues ahí las personas que hacen electromicroscopía en NIDA.
Y esto es lo que tenéis aquí.
Son sinapsis en el núcleo accumbens core,
donde veis un precipitado en la parte presináptica.
Es el axón que viene de la corteza prefrontal
y que está tenido con DAB,
porque es MCHERRY, reconociendo el anticuerpo.
Y tenéis en la parte postsináptica a la izquierda, Inmunogold, o sea,
revela el marcaje positivo para la proteína S6.
Entonces, hay un aumento en el terminal postsináctico
o en la espina de estas proteínas del ribosoma.
¿Qué pasa con carcinurina?
Pues cuando vimos carcinurina, en la parte postsináctica
o en la espina,
a pesar de que hay carcinurina, no hay un aumento.
Sin embargo, para nuestra sorpresa, grata sorpresa,
en la parte presináctica o en el axón
es donde vemos el aumento.
O sea, la calcinurina está aumentando en la parte presináptica
y S6 o el ribosoma está aumentando en la parte posináptica.
Podría ser potencialmente un buen marcador presináptico
y otro posináptico.
Pero estos cambios lo importante es también demostrar
que dependen de actividad.
Entonces hicimos un experimento sencillo
donde la rata se anestesia 10 minutos antes de inyectar con cocaína,
ya se había demostrado que FOS deja de expresarse.
Y ahora lo que queremos ver, si S6 y calcineurina
dejan de aumentar.
Y eso es lo que pasa en las barras que están en negro,
ven que el efecto, o sea, se bloquea el efecto de aumento
cuando 10 minutos antes le inyectas chloral hydrate,
¿ya?
El anestésico.
Entonces, son.
Todo esto está hecho con cocaína, hay droga, es un efecto farmacológico
y hay un contexto nuevo.
Entonces, primero, también nos preguntaron, de hecho,
qué pasa si no hay droga y qué pasa si solamente hay contexto.
Eso es lo que hicimos aquí,
cuando en un contexto novedoso, novel context,
Si no hay droga, se inyecta salino,
igual hay un aumento en S6.
O sea, hay una activación en un ambiente nuevo
y también hay una relación con un aumento con S6.
Con carcinurina no vemos ese aumento,
se necesitan ambas cosas.
Se necesita el efecto farmacológico de la droga
y el efecto del contexto.
Entonces decidimos seguir más con el sexo
y acuérdense que también el sexo a todos los tiempos,
hasta una hora que habíamos visto lo máximo,
sigue aumentado.
Carcinurina era solo en los primeros 10 minutos.
Y por último, quisimos ver en una memoria donde no hay droga
y hay una memoria ya consolidada, como hicimos con cocaína,
pero aquí con comida.
Hacemos el entrenamiento, hacemos los 3-4 semanas de abstinencia
y después el relapse.
Y comparamos lo que pasa en una rata expuesta,
reexpuesta de nuevo al contexto y a la clave del entrenamiento.
Y bueno, esto es para mostrar que tienen buen seeking.
Y aquí, para demostrar que cuando vemos en la izquierda,
el gráfico de la izquierda,
Todos los inputs que van al núcleo accumbens,
no hay cambio.
Pero de nuevo, cuando solo nos identificamos
los que vienen de la corteza prefrontal,
porque están tenidos con la proteína amarilla,
YSP, esos son los que tienen el cambio.
El circuito PFC, núcleo accumbens,
esa sinapsis aumenta de nuevo a SIX.
Dando indicativos de que es un marcador independiente
del efecto farmacológico, independiente
de una activación inespecífica.
Esto es memoria dependiente.
Y en resumen, pues eso es lo que les quiero resumir aquí.
Cuando inyectamos cocaína en un ambiente novedoso,
obtenemos ambas S6, el ribosoma y calcinurina aumentada.
Cuando inyectamos salino en vez de cocaína,
Igual S6 está aumentada.
Si inyectamos cocaína en su caja, en un ambiente novedoso,
no hay ningún aumento de ninguno de los marcadores.
Y cuando hacemos food seeking, lo hemos hecho también
con cocaine seeking, hay un aumento de S6,
del ribosoma.
Entonces postulamos que la proteína ribosomal S6
es un buen candidato y un marcador que podemos usar
para identificar activación sináptica o sináptica en sámboles
de la misma manera que identificamos en neuronal
en sámboles por la expresión de FOS o otros inmediately genes.
Y por último les voy a hablar de lo que estamos ahora,
que está caliente, como dicen allí,
pero algunas imágenes hace una semana que las he obtenido,
pero pues con mucha sorpresa
y muy agradecido por las colaboraciones que tenemos.
O sea, si la proteína S6 está aumentada,
significa el ribosoma, asumimos que el ribosoma aumenta
en la espina, entonces estamos hablando
de que el ribosoma transloca, esa es una de las hipótesis,
está translocando desde la dendrita hasta la espina
porque está recibiendo un input y se está activando.
Por tanto, si hay más ribosoma,
el ribosoma lo que hace es fabricar proteínas.
Debería haber más proteínas.
Entonces, deberíamos estudiar qué otras proteínas aumentan,
porque puede ser la punta del iceberg el ribosoma,
pero hay otras proteínas más específicas que aumentan localmente.
Entonces, para eso necesitamos aumentar la resolución.
En el análisis de imágenes y aumentar la sensibilidad
de los métodos de proteómica que existen.
Bueno, pues esto es una animación solo para ver que esta
básicamente es la hipótesis.
Una vez que el PFC,
los inputs relacionados con la memoria de cocaína o comida,
se activan las espinas, hay una translocación de SIGS.
Y eso es lo que tenemos que demostrar.
Entonces, ¿cómo lo vamos a estudiar ahora?
Pues ahí, gracias a grandes.
Grandes colaboraciones que tenemos.
Esto es una neurona típica, hacemos secciones de 100 micras,
hacemos el clarity,
o sea, se hace un procedimiento para que.
Podamos tener mayor resolución.
Sin embargo, aquí veis en rojo la proteína del ribosoma, S6.
Se ve muy bien perinuclear,
pero es muy difícil de ver en la dendrita y en la espina.
Y esto es una baja magnificación,
pero os digo que en alta magnificación tampoco.
Se consigue ver bien.
Esto, por ejemplo, que lo que está en blanco
no lo creáis, pero lo hace el programa,
pero no se ve bien dónde está SIX dentro de dendritas
y de espinas.
¿Por qué?
Una de las hipótesis es porque no tenemos suficiente resolución
y entonces.
Queremos ver dónde está en la cabeza,
cuándo está en el cuello y cuándo está en la base.
Para eso hay dos alternativas.
Si queremos aumentar la resolución hay dos alternativas posibles.
La primera opción es aumentar la resolución de los objetivos.
Pero todo tiene un límite.
Aquí pongo el primer teléfono, la primera foto que se envió
a la izquierda de un teléfono normal,
superpixelada y una foto a la derecha de un iPhone.
La resolución ha cambiado, ¿no?
Muchísimo, pero de tómanes tenemos un límite,
el límite de 250 nanómetros, el límite de la luz visible.
Entonces, esa es la opción una, podemos crear microscopios
de superresolución,
puede ser tedioso, ok, eso es una opción.
La segunda opción es, aquí estoy en la Sagrada Familia el año pasado,
con uno de vuestros amigos y alumnos antiguos,
con Javier, Esto es una maqueta,
entonces podemos ver la amplificación,
la expansión de esa maqueta hecha realidad.
Entonces, eso es lo que decidimos hacer,
aumentar el tamaño de la muestra,
el tamaño del cerebro y el tamaño de la espina,
para poder ver la localización de ESICS.
Entonces, decidimos usar este método, Expansion Microscopy,
El año pasadolo pusimos a punto, bueno, no lo pusimos a punto,
lo replicamos.
Este es el paper de las personas que pusieron a punto
secciones en vez del cerebro completo,
que fue originalmente un science en el 2015.
Pues este protocolo que se llama MAP, Magnified Analysis of Proteome,
con secciones se puede aumentar y se puede tener buena resolución,
muy buena, para proteínas sinápticas.
Entonces, esta es la medida normal de 6 milímetros de un lado derecho
del hemisferio derecho de un hipocampo de rata
y cuando hacemos la expansión es increíble
porque es que empieza a aumentar y bueno,
pues ahí tienen más o menos cerca de 4 veces
el hipocampo.
Ahora mide 20 milímetros lo que antes medía 6 milímetros.
Y bueno,
esto es solo una representación del detalle que se consigue
con solo un objetivo de 4X.
Esto es un objetivo de 4X en un confocal y lo otro
es un zoom digital, lo de la derecha.
Entonces, en el zoom digital podéis ver.
Dos proteínas, una presináptica, perdón, ERC1,2,
y la otra posináptica, PSD95, que están bien definidas,
están juntas y están formando una sinapsis.
Entonces, con este nivel de resolución,
cuando aumentamos el tamaño de la muestra,
no necesitamos grandes microscopios,
un microscopio o un objetivo bien normal.
Y aquí tenemos, bueno, pues igual,
antes de la expansión tenemos un objetivo 20X,
ahora tenemos la proteína S6, cómo aparece, cómo se ve,
y lo que empezó a ser promising, sé cómo se dice ahora, pero bueno,
que empezamos a ver que cerca del nucleolo,
en blanco veis DAPI, Cerca del nucleolo aparecen unos clústeres,
unas agrupaciones de tinción con el anticuerpo S6,
donde se están formando ribosomas biológicamente.
Entonces, fue un buen indicativo,
pero igual no podríamos tener buena resolución en las espinas.
Entonces, ahora estamos reproduciendo.
En este caso,
bueno, estamos reproduciendo el protocolo de expansión,
pero con una colaboración que tenemos dentro de Naida.
Estas son imágenes recientes de hace diez días como mucho, donde es
una reconstrucción donde podemos ver a la izquierda una espina tipo Masron
y podemos ver en rojo la proteína SIX o el ribosoma.
Entonces podemos ver que en la cabeza está localizado
frente a otra espina que tenemos a la derecha que tiene menos señal
para el ribosoma SIX.
Entonces con este tipo de imágenes tenemos que hacer algún control más.
Podríamos diseñar un experimento para comprobar
que hay una traslocación.
¿Cuáles espinas se están activando dentro de las neuronas que son
FOS-positive?
Contarlas y después también localizarlas.
Si están en la dendrita o están en la cabeza de la espina.
Y comparar con las que no están activadas,
esperando que haya menos en la cabeza de la espina.
Esto es una expansión del cerebro de 11,
os podéis imaginar 11 veces y en total es una magnificación
de como 440 pero usando un confocal normal.
¿Podemos identificar y cuantificar proteínas que se estén sintetizando
de nuevo?
Esa es la otra pregunta que queremos responder.
El ribosoma está ahí,
entonces se están sintetizando nuevas proteínas.
Pues aquí tenemos una buena colaboración
también con gente de la Universidad de Maryland,
donde ya hemos mandado a publicar el primer validación
de lo que se llama.
Deep Proteome Profiling, o sea, un análisis proteómico profundo
de los sinactoniosomas donde se pueden.
Bueno, esto es muy complejo esta figura,
pero a mí me encanta porque tienes.
Estas son todas las proteínas que se han identificado
en nuestras muestras.
O sea, hay proteínas postsinácticas en la parte de abajo
y proteínas presinácticas, proteínas de citosol,
proteínas de membrana y.
Aquí tienen el análisis diferencial donde vemos proteínas que están,
esto es solamente en mezanfetamina, una inyección intraperitoneal
para validar el protocolo, pero hay un aumento de proteínas,
81 proteínas diferencialmente y una disminución de 66 proteínas.
Y bueno,
pues con esto suelo decirles que se pueden obtener
hasta más de 6.000 proteínas a partir de estas muestras.
Ahora ya tenemos las primeras muestras después de hacer sorting,
o sea, solo las que son específicas de la corteza prefrontal
núclea cumvens.
Hemos hecho el sorting usando FACS
y podemos detectar hasta 2000 proteínas.
Entonces, es un paso hacia adelante a poder estudiar a profundidad
y en detalle las proteínas que se sintetizan en respuesta
a una activación localmente en las sinapsis.
Y bueno, con eso quiero agradecer especialmente
a todos los colaboradores.
Carlos, que nos ayuda en las espinas y en el análisis de las espinas.
Chris Dan, que no he podido poner la foto
y no me cabía ahora ahí, pero bueno,
él es uno de estos que sabe de citometría de flujo
y no solo sabe,
sino que se ha querido arriesgar en hacer algo que nadie hace
y que cuesta validarlo.
Y Steven, que es el director del departamento de electromicroscopía.
Annalie, que es amiga y con la que he publicado antes
varias cosas.
Trabajaba con Yavin Shahan y ahora tiene su propio laboratorio.
Y con Peter Nemes, que es el especialista en proteómica.
Y bueno,
pues con eso este es el laboratorio actualmente.
Han pasado muchos post-bac,
gente que me ha ayudado en estos 12 años.
Y bueno, Bruce Hope, que es el PI, es el que está a la izquierda,
el más joven.
Y bueno, pues muchas gracias a todos por vuestra atención
y ahora si queréis hacerme alguna pregunta,
pues agradecido de responderla.
Pues muchísimas gracias, Javier.
Yo creo que ha sido precioso el seminario.
¿Tenéis alguna pregunta?
Javier, muchas felicidades.
Gracias.
Ha sido una conferencia magnífica en todos los sentidos.
Yo me llamo Emilio Ambrosio.
Ya nos conoceremos.
Ya luego te saludo personalmente.
Quería preguntarte, Javier, cuando nos has explicado.
Que se mandan proyecciones desde la corteza medial prefrontal
al núcleo de acúmbens y habéis determinado
que se activa, digamos, se sintetiza la proteína S ribosómica.
Todas las proyecciones que se mandan son glutamatérgicas,
te pregunto yo eso.
Si son glutamatérgicas o no, todas las que se mandan.
Y luego también preguntarte si los animales que habéis empleado
son de un único sexo y la edad que tienen.
Muy bien, pues gracias por la pregunta.
La primera, ya, es muy buena la pregunta.
Usamos el promotor de calmudlín quinesa.
Se supone que deberían ser solo proyecciones glutamatérgicas.
Pero, bueno, esa es la respuesta breve.
Y luego usamos machos y hembras.
Y a partir de tres meses,
la verdad es que es por tiempo más que por peso,
pero a partir de tres meses ahí empezamos la cirugía
hasta que termina,
pues otros dos meses máximo termina el experimento.
¿Y encontráis diferencias entre ambos sexos?
A ver, en mi caso concreto no lo he separado por sexos
y sería muy bueno hacerlo.
Gracias por la pregunta, lo voy a mirar.
No puedo contestar.
En otros casos o con otros investigadores.
En algunos casos ven diferencias.
No es normal.
Bueno, allí es una política del NIH que tenemos que hacerlo
con machos y hembras siempre.
Entonces, cuando alguien encuentra diferencias,
no es lo normal en este tipo de conductas,
encontrar diferencias.
Pero alguno lo empieza, no sé específicamente con qué droga
o en qué condiciones.
De nada.
Hola, profesor Javier.
Hola.
Felicitaciones por la conferencia.
Como dicen en Chile, te pasaste.
Esto, no, solo una curiosidad, ¿no han pensado o han hecho,
no sé, también ver amígdala, amígdala central,
vasolateral, también esos análisis?
Y luego también,
como tienen en cuenta también machos y hembras,
no sé si han medido también niveles hormonales del costicosterona, ¿sí?
Y luego también en la fase si están estro, proestro, metraestro,
si eso de pronto puede correlacionar un poco.
Gracias por la pregunta.
La primera pregunta, de hecho,
la primera vez que inyecté virus para las proyecciones,
inyecté dos virus.
Uno era en la corteza prefrontal y el otro en la corteza motora
como control.
En ese caso, el virus que utilicé era infrared, la proteína,
y en la citometría de flujo no se ve bien.
Entonces, quiero hacer eso, quiero hacer dos circuitos a la vez.
O sea, se puede hacer, solo tienes que cambiar el fluoróforo.
Entonces, puedes analizar dos circuitos,
sinapsis, en la misma rata, en el mismo tejido,
pero ahora tienes dos tipos de sinapsis
y puedes analizar perfectamente y distinguir,
siempre que tengas dos fluoróforos distintos.
Y por la otra pregunta, no tengo experiencia
de trabajar solo con hembras o hacer este tipo de estudios hormonales.
De momento no está en mente,
a no ser que encuentre algo distinto luego cuando empezamos a ver
diferencias entre machos y hembras,
cuando vea los datos de otra manera.
Veo la mano de Marta Miquel levantada a través del Teams.
Marta.
Aquí estoy.
Buenas.
Hola, Javier.
Hola, Marta.
Ah, ¿qué tal?
¿Te acuerdas de Cerebellum Girl?
Oye, tengo dos preguntas.
Una, en la primera parte de tu charla, lo que mostrabas
era que en esas sinapsis en medial, prefrontal, cortes, nucleocambiens,
aquellas neuronas, aquellas sinapsis que no estaban activas, ¿no?
O sea, ¿eran sinapsis o neuronas?
Es que ahora ya.
Las que eran neuronas,
porque eran las que eran sifos negativas.
Ajá, sí, sí.
Ahí es donde tenías el incremento.
Sin embargo,
lo que observabas era un decremento en las que sí que estaban activas,
del tamaño de la espina.
El tamaño de la cabeza, ajá.
De la cabeza, sí.
Vale.
Es que, claro, ¿tú te acuerdas de esos datos de Peter Calaivas,
del grupo de Peter Calaivas?
Sí.
Que con todas las drogas,
porque lo han hecho con muchas drogas,
testaban qué pasaba durante la drug relapse y ellos demostraban
que durante los primeros tres minutos después de la aparición de la Q,
las espinas dendríticas aumentaban, las mushroom aumentaban de tamaño.
Y era porque había un tráfico de AMPA receptors a la membrana.
Entonces yo me pregunto, claro, según tus datos,
esas espinas dendríticas que se expanden durante el relapse serían
las que corresponderían a células que no estarían expresando FOS,
no estarían activadas.
¿Sabes por dónde voy?
Sí, sí, sí, te entiendo, te entiendo.
Y mira, muy buena pregunta porque no lo expliqué bien,
aunque estaba en el circuito, en la diapositiva.
En nuestro protocolo dejamos 30 minutos,
son las condiciones del test, del seeking,
y después le dejamos otros 30 minutos adicionales en su jaulita,
como descansando.
Entonces, es distinto al.
¿A qué voy?
Estos cambios que vemos.
Son no dependientes del seeking,
como en Calibas, que era durante el seeking.
Esto es después del seeking.
Han pasado 30 minutos y estos cambios son los que vemos a ese punto.
Es verdad que sería muy interesante
ver qué pasa inmediatamente después del seeking.
En nuestro caso, como es FOSS,
necesitamos 60 minutos está bien para ver la proteína,
30 minutos no sería suficiente.
Entonces, no sé si eso algo te responde.
Sí, sí, totalmente, totalmente.
Claro, el timing es muy diferente, claro.
Porque es que realmente lo que ellos demuestran
es que a partir de 3 minutos de la aparición de la Q
se normaliza el tamaño de la smartphone.
Entonces, claro, si vosotros lo que estáis ya demostrando sería.
Short term plasticity, es decir,
lo que empieza a pasar cuando ya hace un tiempo a corto,
en corto, bueno, un periodo corto,
pero ya hace un tiempo después de la Q. Vale, ok.
Y la otra pregunta es que vamos, claro.
Ese no es vuestro objetivo.
A lo mejor lo que te estoy preguntando es una tontería,
pero mi cuestión es un ensamble o un engrama
es algo que implica muchas regiones.
No todas las regiones están implicadas en todas las fases
de la memoria.
De acuerdo.
Y claro, vosotros no distinguís si.
Si esos cambios corresponden necesariamente a la adquisición
o a la consolidación, ¿no?
O sea, y esa región,
porque claro, esa región en la que estáis trabajando
está fundamentalmente implicada en la adquisición,
en los procesos de.
Claro, yo trabajo en cerebelo que muy probablemente el engrama
no esté ahí, o por lo menos el inicial, ¿no?
Pero se necesita para la consolidación
y la modulación.
¿Habría alguna manera de.
De separar las fases de la memoria
y ver qué cambios corresponderían a la primera o a la consolidación
o te parece una locura?
No, es muy buena pregunta, no es ninguna cosa trivial.
Muy, muy interesante.
Lo único que se me ocurre o que pensamos,
pues el hecho de usar estos animales transgénicos,
FosTrap, Ahora estamos haciendo, estamos validando una rata.
Para los que les gustan las ratas, estamos haciendo FosTrap2.
Ya está hecha.
Estamos validando, estamos en el primer experimento.
Entonces, ¿se podría marcar neuronas durante la fase de adquisición
FosPositive?
Y después, al final del test,
podríamos saber qué neuronas se activaron con la adquisición
y las que se activaron con el seeking,
pues hacemos la atención clásica con FOSS.
Ahora, los cambios que veríamos en las primeras neuronas
de la adquisición sean cambios a largo plazo al final, ¿ya?
Al final del seeking test.
Entonces, no sé si esos cambios
serían los mismos que si cortáramos, por decirlo así,
si después de la adquisición.
Es el final del experimento
y analizamos si esos cambios son a largo plazo
y entonces o coincide que esas neuronas de la adquisición
hacen overlap con las que se activan durante el seeking.
Esa es una de las preguntas que siempre hemos.
Perseguido, ¿no?
¿Cuánto de la adquisición
proviene de ahí o son nuevas en cierta manera?
Ya, ok, es interesante.
Muchas gracias.
Flipante la conferencia, flipante.
Gracias.
Gracias, Marta.
Hola, Marta.
Hola, Nuria.
Hola Javier, muchas gracias por la conferencia,
ha sido súper interesante.
Me ha entusiasmado ver tantas técnicas distintas,
tan elegantes,
o sea, algunas parecían de ciencia ficción, francamente.
Una de ellas en concreto me ha llamado mucho la atención,
esta que utilizabais en la que introducíais la beta-galactosidasa
y solamente la expresaban aquellas neuronas
que habían sido activadas por cefos, ¿no?
Me ha quedado la duda, cuando has mencionado esta técnica,
de si introducíais esta beta-galactosidasa
con un vector viral
o si ya, digamos, al gestar esos ratones,
pues los hacéis transgénicos ahí de base.
Son transgénicos de base, sí.
Ahí me queda otra duda.
Entonces, ¿no podría ser que.
Igual la pregunta es una tontería,
pero por eso preguntamos que aprendemos todo.
No, no hay tontería.
¿No podría ser que a lo largo de la vida de ese ratón,
hasta que hicierais ese aprendizaje por cocaína,
se le fueran muriendo neuronas que activaran cefos?
Ajá.
Sí, bueno, tenemos el control básicamente,
o sea, inyectas el vehículo que no tiene la prodroga
y ese es el control de la técnica, ¿no?
Entonces, solo el vehículo, que el vehículo es raro,
porque tiene DMCO, ¿no?
Entonces, por eso necesitas, a veces están muriendo por el DMCO,
¿ya?
Pero se ve la diferencia,
o sea, está normalizado con ese control técnico.
Claro, claro.
Claro, me había caído que esa prodroga,
imagino que la inyectaréis justo antes de comprobar ese.
Sí, la prodroga es intracranial y se inyecta 90 minutos,
creo que es el peak ideal,
después de haber empezado una conducta.
Y después se deja hasta el tercer día.
Para que haga efecto y vaya muriendo las neuronas,
y comprobar si hay O sea, se hace un pequeño test,
como de unos 15 minutos,
y se hace un segundo test después.
El primero es para inducir.
Genial, muchas gracias.
De nada.
Bueno, Javier, muchísimas gracias por la charla,
que yo, por supuesto, me uno a las muestras de agradecimiento
y a las felicitaciones.
Cuando, claro, el S6 y calcineurina os salieron en el estudio
que hicisteis, era secuenciación, ¿no?
De citometría de flujo, anticuerpos.
Teníamos candidatos en mente con anticuerpos que servían.
Vale, entonces, bueno, es que, claro, S6.
Como proteína,
o sea, como depende tanto de la fosforilación para.
¿Sí?
Ah, es que como me he salido.
No sé, te iba a preguntar si, claro, solo usar S6 en vez de fosfo S6.
Ah, sí.
Es que igual justo lo has contado cuando me salió.
Sí, usamos fosfo S6, no encontramos cambios,
pero yo sigo.
Yo no estoy contento con eso.
No sé si es que hemos perdido fosforilación en el procedimiento,
a pesar de que usamos inhibidores de fosfatasas.
Entonces,
porque ni calmodulínquinesa,
forforilada, no vemos aumento, y force for six,
que es lo que yo esperaba, no.
Ahora, con la técnica de expansión y con el ensayo de imágenes,
sí que podemos identificar el SIX
y lo siguiente que vamos a hacer es utilizar el anticuerpo FORFOR SIX
para ver los dos dentro de las espinas.
Y luego, la técnica de expansión,
ya esto es una cosa de curiosidad técnica, ¿requiere algún aparataje
muy sofisticado?
No.
No, no, no.
No requiere aparato sofisticado, un montón de productos.
Básicamente, en palabras sencillas, es como.
En palabras sencillas, por el que lo hizo la primera vez.
Es como.
Es la técnica del pañal.
O sea, el pañal absorbe el agua y se expande.
Lo que se hace aquí es un polímero del cerebro.
Entonces tienes un polímero que después
cuando le pones agua destilada.
Cuanto más agua destiladale pongas, más se va a expandir.
Lo que cambia es, el protocolo que repliqué,
publicado el año pasado, se tarda 10 días.
Son 10 días de distintos procedimientos,
incubación, esto el procedimiento que están haciendo ahora
que están en colaboración con un kit en dos días lo suelen hacer
y pueden expandir hasta 11 veces pero no es sofisticado necesitas
un horno necesitas comprar los reagentes hornos
y nada más no es sofisticado es que bien muchas gracias
alguna pregunta más aquí en la sala no.
¿Y alguien en casa?
Pues yo creo que te vamos a dejar tranquilo.
Así que, bueno, como vamos a seguir toda la mañana hoy contigo,
pues cualquier pregunta que se nos ocurra sobre la marcha
podemos ir tomando los bollos de fuera.
Muchas gracias, Javier.
Muchas gracias por venir.